产品概述

          杀稻瘟菌素S 是一种从灰色链霉菌（Streptomyces griseochromogenes）中提取的核苷类抗生素。其作用机制是通过干扰核糖体与肽段的结合，特异性抑制原核和真核细胞的蛋白质合成。具体而言，它阻断释放因子诱导的肽基-tRNA水解，并抑制肽键的形成。

           当细胞成功转染携带 bsr、BSD 或 bls 抗性基因的载体后，会表达脱氨酶，将杀稻瘟菌素S转化为无毒的脱氨基羟基衍生物，从而使细胞获得抗性。

           产品特点：杀稻瘟菌素S具有快速而强效的作用模式，很低的抗生素浓度便能导致未携带抗性基因的细胞迅速死亡。

杀稻瘟菌素盐酸盐

使用方法

（一）粉末配制储存液方案

         如购买的是粉末形态，需先配制成储存液后再使用。

          配制步骤（目标浓度：10 mg/mL）

      1.计算用量：根据需要量计算粉末重量。例如，配制 10 mL 储存液需称取 100 mg 粉末。

      2.选择溶剂：推荐使用 无菌1 M HEPES缓冲液（pH 7.3–7.4） 或 1× PBS。

      3.HEPES为优先选择：能稳定维持pH，加入培养基后不改变培养体系的酸碱度。

      4.溶解：将粉末溶于约 80% 最终体积的溶剂中，充分涡旋或颠倒混匀，直至完全溶解。

      5.本品在水中溶解性良好，室温下溶解速度较快。如温度过低可能影响溶解性，可适当升温助溶。

      6.定容：加溶剂定容至最终体积，再次混匀。

      7.pH检查：溶液pH应在 4.0–7.0 之间。如有必要，可用 1 N NaOH 调节至 pH 7.0–7.4（注意不要过碱）。

      8.过滤除菌：使用 0.22 μm 滤膜 过滤除菌-。

      9.注意：粉末为非无菌包装，若用于细胞培养，必须过滤除菌。

    10.分装与保存：分装成单次使用量（如 500 μL–1 mL/管），-20℃ 避光保存。

杀稻瘟菌素即用型溶液（10 mg/mL）

重要注意事项

        1.严格避光：本品对光敏感，应使用铝箔包裹或存放于避光处。

       2.避免反复冻融：反复冻融会导致效价显著降低。建议将溶液分装成单次使用量的小份保存。

       3.防潮保存：粉末形式应在干燥条件下保存，避免吸潮。

       4.取用前平衡：从 -20℃ 取出后，建议在室温平衡 15–30 分钟后再开盖，避免冷凝水污染。

     （一）即用型溶液稀释方案（从 10 mg/mL 到工作浓度）

       由于储存液浓度较高（10 mg/mL），配制低浓度工作液（如 2–5 µg/mL）时，取液体积通常小于 5 µL（配制小体积时）。强烈建议先配制一个中间浓度稀释液，再二次稀释至目标浓度，以提高准确性。

       中间稀释法示例（配制 10 mL 的 2 µg/mL 工作液）：

       第一步：取 10 µL 10 mg/mL 储存液 + 990 µL 无菌 PBS/HEPES → 得到 100 µg/mL 中间液（稀释 100 倍）。

       第二步：取 200 µL 上述中间液 + 9.8 mL 培养基 → 得到 10 mL 的 2 µg/mL 工作液（再稀释 50 倍）。总稀释倍数 = 100 × 50 = 5000 倍（10 mg/mL ÷ 5000 = 2 µg/mL）。

        计算公式：C₁ × V₁ = C₂ × V₂

        配制速查表（以 10 mg/mL 储存液为例）：

     含药培养基建议现用现配，4℃保存不超过 2 周。

        （二）确定最佳工作浓度——杀灭曲线（Kill Curve）

        这是最关键的一步！ 灭瘟素S的最佳筛选浓度因细胞类型、培养基和生长条件而异，首次使用时必须通过杀灭曲线确定。

推荐工作浓度范围：

部分常见哺乳动物细胞参考浓度：

      以上浓度仅供参考，实际使用需通过杀灭曲线验证。

(一)杀灭曲线操作流程：

       1.铺板：将未转染的细胞以约 20–25% 的密度 接种于 24 孔板中，37℃ 培养过夜。

       2.设定浓度梯度：以哺乳动物细胞为例，可设定 0、2、4、6、8、10 μg/mL 等梯度。每个浓度设 2–3 个平行孔。

       3.加药：次日更换为含不同浓度灭瘟素S的新鲜培养基。

       4.换液与观察：每 3–4 天 更换新鲜含药培养基。每日观察并记录存活细胞比例。

       5.确定浓度：选择在 7–10 天 内能杀死 绝大多数（≥99%） 未转染细胞的最低浓度，即为最佳筛选浓度。

       6.重要提醒：灭瘟素S作用快速而强效，细胞死亡迅速发生。在 低至 2–10 μg/mL 的浓度下即可有效杀死敏感细胞。

    （二）哺乳动物稳转细胞株筛选流程

       1.转染/感染：将携带 bsr 或 BSD 抗性基因的质粒转染或病毒感染目标细胞。同时设置未转染的阴性对照。

       2.恢复培养：转染/感染后 48–72 小时，让细胞表达抗性基因。

       3.加药筛选：更换为含有 最佳筛选浓度（由杀灭曲线确定）灭瘟素S的新鲜培养基。

       4.关键：细胞应处于活跃分裂期，密度不宜过高（覆盖率 ≤25%），密度过高会降低抗生素效率。

       5.维持筛选：每 3–4 天 更换新鲜含药培养基。

       6.克隆筛选：当对照组细胞 100% 死亡时（通常 7–10 天），抗性组中存活的细胞即为稳定转染细胞。可根据实验目的进行多克隆或单克隆筛选。

     （三）稳转株维持培养

          成功筛选出稳转株后，维持培养可采取以下方式之一：

       1.使用与筛选相同浓度的灭瘟素S维持培养。

       2.将抗生素浓度降低至筛选浓度的一半进行维持培养-。

       3.使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的浓度（根据杀灭曲线判断）。

     （四）大肠杆菌筛选注意事项

       1.大肠杆菌对灭瘟素S的敏感性较弱。

       2.需使用低盐 LB 培养基（NaCl ≤ 5 g/L，pH 8.0）进行筛选。推荐浓度：50–100 μg/mL。

       3.高 pH 值（pH 8）可增强灭瘟素S的活性。

      常见问题

          可以直接用培养基稀释吗？

        可以。根据工作浓度，按比例在无菌细胞培养基中直接添加本产品即可。

        含药培养基能保存多久？

           4℃ 下建议 不超过2 周。

        筛选需要多长时间？

        通常 7–10 天即可完成阳性克隆筛选。

        大肠杆菌筛选为什么用低盐LB？

        高盐浓度（>90 mM）会抑制灭瘟素S活性。低盐 LB 中 NaCl 含量应 ≤5 g/L。

        溶液出现沉淀或变色怎么办？

       可能因保存不当导致降解。建议停止使用，重新配制或更换新批次。

        灭瘟素S的作用原理是什么？

       通过干扰核糖体与肽段的结合，特异性抑制原核和真核细胞的蛋白质合成。bsr/BSD基因编码的脱氨酶可将灭瘟素S转化为无毒的衍生物。