1. 产品概述
BCX 1470 是一种合成的低分子量丝氨酸蛋白酶抑制剂，靶向补体经典途径的 C1s 与替代途径的 Factor D 两种关键补体酶。
其体外酯解抑制 IC50 分别为 0.0016μM（C1s）和 0.096μM（Factor D），溶血抑制 IC50 分别为 0.046μM（经典途径）和 0.33μM（替代途径）。
目录号：KG12191
靶点：补体丝氨酸蛋白酶 C1s（经典途径）与 Factor D（替代途径）
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酶 |
IC50 |
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C1s |
0.0016 μM（1.6 nM） |
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Factor D |
0.096 μM（96 nM） |
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Trypsin |
0.326 μM |
2. 产品详情溶解性与配制（文献记录）
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参数 |
内容 |
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产品名称 |
BCX 1470 |
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分子式 |
C14H10N2O2S2 |
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分子量 |
302.4 g/mol |
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SMILES |
C1=CSC(=C1)C(=O)OC2=CC3=C(C=C2)C=C(S3)C(=N)N |
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InChIKey |
OTGQTQBPQCRNRG-UHFFFAOYSA-N |
3. 作用机制
3.1 靶点：补体丝氨酸蛋白酶 C1s 与 Factor D
BCX 1470 是一种合成的低分子量丝氨酸蛋白酶抑制剂，靶向两种关键补体酶：经典途径的 C1s 与替代途径的 Factor D。
3.2 酯解活性抑制（IC50）
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酶 |
IC50 |
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C1s |
0.0016 μM（1.6 nM） |
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Factor D |
0.096 μM（96 nM） |
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Trypsin |
0.326 μM |
选择性：BCX 1470 抑制 C1s 酯解活性的效力比胰蛋白酶高约 200 倍，抑制 Factor D 的效力比胰蛋白酶高 3.4 倍。
3.3 溶血活性抑制（IC50）
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溶血途径 |
IC50 |
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经典途径 |
0.046 ± 0.011 μM（46 nM） |
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替代途径 |
0.33 μM（330 nM） |
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Factor D 溶血 |
0.075 ± 0.013 μM |
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Factor B |
无抑制（NI），高达 20 μM 仍无抑制 |
关键结论：BCX 1470 对经典途径溶血的抑制比替代途径强约 7 倍；对替代途径的抑制是通过抑制 Factor D 实现的，不抑制 Factor B。
3.4 与对照抑制剂的效力比较
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对照 |
比较内容 |
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Trypsin |
C1s 选择性窗口约 200 倍；Factor D 约 3.4 倍 |
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FUT-175 (nafamostat) |
Factor D 抑制效力高出 >100 倍（BCX 1470 IC50 ~96–100 nM vs FUT-175 >10 μM） |
4. 体外实验方法
4.1 酯解活性测定（Esterolytic assay）
目的：测定 BCX 1470 对 Factor D、C1s 和 Trypsin 酯解活性的抑制能力。
反应体系：
l 底物浓度：1.29 mM；
l 缓冲液：0.1 mM HEPES、0.5 M NaCl、10% DMSO；
l 反应体积：200 μL/孔，96 孔微孔板；
l 酶浓度：Factor D 104 nM；C1s 3–13 nM；Trypsin 适量（论文 Table I 条件下测定）。
底物与检测：
l Factor D 和 C1s：底物为 benzyloxycarbonyl-Lys-thiobenzyl，水解后释放活性基团，与显色剂 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 反应，在 405 nm 监测吸光度变化。
l Trypsin：底物为 Na-benzoyl-L-Arg-nitroanilide，直接在 405 nm 监测。
抑制实验操作：
1. 将 BCX 1470 加入含目标酶的 100 μL 测定缓冲液中；
2. 加入 100 μL 底物启动反应；
3. 使用 Vmax Kinetic Microplate Reader 在 405 nm 连续监测 200 s，自动计算底物转化速率（mOD/min）；
4. 阴性对照：缓冲液 + 底物 + 抑制剂，不加酶；
5. IC50 计算：在半对数图上以“抑制百分比 vs 抑制剂浓度”作图，抑制百分比 = [(无抑制剂时速率 − 有抑制剂时速率) ÷ 无抑制剂时速率] × 100。
4.2 溶血活性测定（Hemolytic assay）
（一）经典途径总溶血活性
l 靶细胞：兔抗体致敏的绵羊红细胞，1.5 × 10^8/mL，100 μL；
l 血清：100–600 μL 适当稀释的人或大鼠血清；
l 缓冲液：GVB²+（veronal-buffered saline，pH 7.3，含 1 mM MgCl2、0.15 mM CaCl2、0.1% gelatin）；
l 终体积：1.5 mL；
l 孵育：37°C，60 min；
l 检测：413 nm 吸光度，计算 CH50 U/mL；
l BCX 1470 抑制实验：在调整终体积前，将 100 μL 系列稀释的抑制剂加入滴定混合物中；以无抑制剂对照计算抑制百分比和 IC50。
l 靶细胞：以豚鼠红细胞替代兔红细胞；其余条件同上。
（二） Factor D 溶血活性
l 靶细胞：神经氨酸酶处理的绵羊红细胞，携带人 C3b（EC3b），2.5 × 10^6；
l 反应组分：250 ng Factor B、6 ng properdin、0.1–8.0 ng Factor D；
l 缓冲液：DGVB-Mg-EGTA，终体积 150 μL；
l 预孵育：30°C，15 min，形成 EC3bBb(P)；
l 终止/洗涤：加入 1.0 mL GVB-EDTA（含 10 mM EDTA、0.1% gelatin），离心，沉淀重悬于 50 μL GVB-EDTA；
l 显色/开发：加入 350 μL 1/40 稀释的豚鼠血清（GVB-EDTA 中），37°C，60 min；
l 检测：413 nm，按已发表方法计算 U/ng。
BCX 1470 对 Factor D 溶血抑制的实验：
l 取 1 个溶血单位的 Factor D（约 1–2 ng，视 EC3b 批次而定）；
l 与系列浓度 BCX 1470 在 30°C 预孵育 30 min；
l 测定残余 Factor D 活性，计算抑制百分比和 IC50。
（三） Factor B 溶血活性抑制实验
l 细胞：EC3bBb(P) 细胞，平均每个细胞约 1 个溶血位点；
l 处理：与系列浓度 BCX 1470 在 100 μL GVB-EDTA 中 30°C 孵育 10 min；
l 显色：用 1/40 豚鼠血清（GVB-EDTA）开发残余位点；
l 计算：IC50。
5. 体内实验方法（大鼠反向被动 Arthus 反应，RPA）
5.1 动物与致敏
l 品系：Sprague Dawley 大鼠，12 周龄，体重 343 ± 15 g；
l 抗原注射：鸡卵白蛋白（OVA）6.6 mg/mL 溶于无菌 0.9% NaCl + 2% Evans blue 染料，10 mg OVA/kg 经左股静脉注射；
l 抗体注射：5 min 后，将兔 IgG 抗鸡卵白蛋白（指定剂量，常用 25 μg 或 20–100 μg）溶于 25 μL 0.9% NaCl，皮内注射；
l 对照部位：注射 25 μL 0.09% NaCl；
l 去聚集：注射前 12,000 × g 离心 5 min 去除聚合物。
5.2 BCX 1470 给药方案
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方案 |
剂量 |
给药时机与途径 |
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单次静脉 bolus |
10 mg/kg |
OVA/dye 溶液混合后，经右股静脉立即注射，紧接着进行皮内 Ab 注射 |
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1 小时静脉输注 |
最终剂量 0.25 mg/kg |
OVA 注射后、皮内 Ab 注射前立即开始输注，持续 1 h |
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对照（无抑制剂） |
— |
给予 5% dextrose bolus 或输注 |
安全性：10 mg/kg 剂量下，大鼠 24 h 存活率 100%
5.3 药效定量：Evans blue 渗出面积
l 取材时间：RPA 启动后 4 h（或指定时点）；
l 操作：处死动物，取注射部位皮肤，外翻、覆盖透明塑料膜，用电子手持数字化仪描记蓝色病变 perimeter，自动计算面积（cm²）；
l 净面积：每个 IgG 注射病变面积减去同动物盐水注射部位的平均面积。
5.4 补体耗竭对照（CoVF 预处理）
l 试剂：Cobra venom factor（CoVF），30 μg；
l 给药：RPA 启动前 18 h，腹腔注射；
l 验证：论文显示该处理使小鼠血清抗原性 C3 降至初始水平的 <3%，并持续至少 48 h；在大鼠和豚鼠中，CoVF 处理后 24 h 内血清抗原性 C3 亦检测不到。
5.5 组织学与免疫荧光（可用于机制验证）
l 皮肤活检：盐水注射部位和 Ab 注射部位，OCT 包埋，液氮速冻，−70°C 保存；
l 切片：4 μm 冷冻切片，从病变周边向注射点方向连续切片；
l H&E 染色：观察水肿等总体病理；
l 免疫荧光双染：TRITC 标记山羊 F(ab′)2 抗兔 IgG（红色）显示 IC 中的兔 IgG；FITC 标记山羊抗大鼠 C3（绿色）显示 C3 沉积；另用 FITC 标记兔抗鸡卵白蛋白显示抗原；
l 共定位：TRITC 与 FITC 重合处呈黄橙色。
6. 数据解读与实验注意事项（基于文献）
6.1 BCX 1470 在 RPA 中的药效数据（文献数值）
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处理组 |
净病变面积（均值 ± SEM，cm²） |
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未处理对照 |
≈ 0.46 |
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CoVF 低补体血症 |
≈ 0.10 |
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BCX 1470 bolus（10 mg/kg） |
≈ 0.21 |
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BCX 1470 1-h 输注（0.25 mg/kg） |
≈ 0.06 |
关键结论：1 小时输注 BCX 1470 的抑制效果与 CoVF 诱导的低补体血症相当。
6.2 血清补体溶血活性监测
l 对照大鼠 RPA 过程中：经典途径溶血活性无显著变化；替代途径溶血活性下降约 50%，在 2.5 h 后显著低于基线（p < 0.05）；
l BCX 1470 输注大鼠：替代途径溶血活性的下降至少延迟 2.5 h；
l 作者解读：BCX 1470 在大鼠体内通过抑制 C1s 和 Factor D 的酶活性来阻断补体激活，从而减轻 RPA 水肿。
6.3 必须明确的限制
l 物种限制：BCX 1470 的体内验证仅在大鼠 RPA 中完成；未在豚鼠或小鼠中测试 BCX 1470。
l 机制细节：文未详细研究 BCX 1470 对组织内各补体成分沉积的影响；作脱靶可能性：论文不能排除 BCX 1470 对 RPA 的作用部分通过抑制其他丝氨酸蛋白酶实现。
参考文献：
The Arthus Reaction in Rodents:Species-Specific Requirement of Complement
本手册内容基于公开研究资料整理，仅供实验参考。具体实验条件需根据所用细胞系和实验体系进行优化调整。
